Elektronmikroskopi: betydning, typer og teknikker




Elektronmikroskopi: betydning, typer og teknikker!

Betydning af elektronmikroskopi: 


Diagnose Virus elektronmikroskop er baseret på påvisning og identifikation af virus på grundlag af deres karakteristiske morfologi. Tidligere forsøg på at se virussen selv med de mest kraftfulde optiske mikroskoper af dagen var en fiasko.

Dette skyldes, at stråling af synligt lys med en gennemsnitlig bølgelængde på ca. 5500 A °. (A ° -Angstrom enheder, svarende til 10-8 centimeter) var ikke i stand til at lysne finere og mere detaljerede aspekter af de virale partikler, som er relativt mindre i størrelse.

De bølgelængder af lys er relativt lange. Derfor partikler med mindre størrelse kan ikke ordentligt løst, dvs. identificeret tydeligt og hver for sig. Dette problem blev løst med udviklingen af ​​elektronmikroskop af Knoll og Ruska i 1931.

Disse instrumenter ikke bruger elektromagnetisk stråling med længere bølgelængder. I stedet er stærke elektronstråler projiceres fra en egnet kilde til løsning objektet under observation. Bølgelængderne af disse stråler af elektroner var meget små, ofte mindre end 1A °. På den anden side, at afstanden mellem de forskellige atomer i et molekyle er mere.

Derfor er det teoretisk muligt at opnå opløsninger på det atomare niveau ved hjælp af disse. Når opløsning på et godt niveau dette er opnået, kan du have forstørrede og forstørrede billeder til den ønskede størrelse. Vi er i stand til at få en forstørrelse på op til 2,000,000X hvor, som fra normal optisk mikroskop er op til 2000X. Brug kikkert billede kan det forstærkes til en maksimal forstørrelse 2,000,000X med JEM 100 S.

Elektronmikroskop består af en elektronkanon, den centrale søjle, elektromagnetiske linser og en fluorescerende skærm (fig. 3). Elektronkanon er beliggende i den øvre del af den mikroskopiske organ, der tjener som elektronkilde. Pistolen er fremstillet af wolframfilament til 30 KV til 150 KV potentiale. Det er omgivet af en negativ skjold med en åbning, hvorigennem en elektronstråle er taget.

Den midterste kolonne er et evakueret metalrør, der er til stede på toppen af ​​pistolen. elektromagnetiske linser eller ruller svarer til kondensatoren, mål linser og okular linse optisk mikroskop og kaldes den kondensatorflader, objektiv og projektor, (fig. 4).

Hver spole har elektriske spoler som afslutning garn på en metallisk hul cylinder. Den elektriske strøm under passagen gennem disse spoler frembringer et magnetfelt aksialt symmetrisk til midten af ​​linsen. Magnetfeltet tvinger elektronerne spiral omkring den centrale akse og forstørre funktioner. Koncentrat kan opnås ved at regulere spændingen.

De fleste elektronmikroskoper operere i ringede af 25-200 KV spænding. Nogle opererer til 1000 kV eller mere. Det dannede billede er observeret på en fluorescerende skærm og ikke direkte, fordi elektronerne er skadelige for øjnene. For at opnå en permanent registrering af billeder, er fotografisk materiale blevet indarbejdet i mikroskop for direkte eksponering for elektronen bjælker.
Typer af Electron Microscope :

Der findes to grundlæggende typer af elektronmikroskoper:

(A) Transmission Electron Microscope (TEM):

Denne elektronmikroskop kan sammenlignes med et lysmikroskop (LM). Det bruger elektroner transmitterede er stand til at trænge den tynde prøve.

(B) et scanningselektronmikroskop (SEM):

Dette kan sammenlignes med en dissektion eller et stereoskopisk mikroskop. SEM bruger spredte elektroner fra prøven overflade, er sekundær eller tilbage spredt, og dermed gøre et tredimensionelt billede.
teknik :

Det første anlæg virus, der skal overholdes i elektronmikroskop var tobak mosaik (Williams og Wykoff, 1943. Siden da, elektronmikroskopi teknologien har forbedret. Mange teknikker i forbindelse med elektronmikroskopi har vist rimeligt klare billeder af (tabel 1) et stort antal vira.

Disse teknikker er:

Ultratynd sektionering:

Denne teknik er nyttig til at studere partiklen i værtscellen. Og 'også nyttigt til at studere krystalstrukturen. Ultratynde snit (25-90 nm) er produceret af faste biologiske materialer, tørrede og indlejret ved hjælp af specielle mikrotomer (mikrotomer termisk eller mekanisk forskud) og glas- eller diamant knive med meget skarpe kanter og hårde kanter.

De optimale karakteristika en ultra-tin sektioner er:

(I) tykkelse fra 30 til 60 nm.

(Ii) sammenhængen tilstrækkelige til at understøtte elektronstråle.

(Iii) modtagelige for god kontrast gennem sin affinitet med farvestoffer.

Glas knive er lavet ved at skære en særlig glas for at opnå en skarp skærkant. Den første model er designet af Sorvall i 1953 og er kendt som Sorvall MT1. En svensk virksomhed producerer ultra-kommercielle mikrotomer med "ultratome" mærke.
negativ farvning :

negativ farvning er en enklere kvalitativ metode til at undersøge strukturen af ​​organeller isoleret, individuelle makromolekyler og elektronmikroskopi niveau virus. Dette er en meget nyttig teknik til dens lethed og hurtighed, og også fordi det ikke kræver specialiseret udstyr forskellig fra den for et normalt laboratorium elektronmikroskopi.

Hall (1955) var den første til uheld viser negativ farvning virkning i en undersøgelse, hvor kolber blev farvet positivt med phosphorwolframsyre. partikler ikke perfekt vaskede blev omringet og indarbejdet i reagenset tørret, og i stedet for at blive vist mørke på en lys baggrund, blev de set lys på en mørk baggrund (fig. 5).

Huxley (1955) har bemærket uafhængigt samme virkning med tobak mosaik virus. Brenner et. til. (1959) også observeret det samme fænomen og kaldte den er negativ farvning. I denne teknik metal pletten forbindelser aflejres omkring viruspartikler så omrids omgiver virusset og gøre elektro-tætte. Derimod hele viruspartikel område fortsat blank trans til elektronerne.

Nogle vigtigste negative pletter med deres normale pH til brug, er:

Natrium eller phosphotungstate (PTA) - 5 til 8

Uranylacetat - 4,2 til 4,5.

Ammoniummolybdat - 5- til 7

Methylamin wolframat - 5.-7

Phosphotungstate (PTA) er en af ​​de mest almindeligt anvendte negative statin. Fremstillingen af ​​virus blev farvet med en vandig opløsning ved 2% af PTA, bragt til pH 7,0 med NaOH eller KOH. Flydende net med adsorberede viruspartikler, et fald på 0,1% glutaraldehyd i 5 minutter, før farvning med PTA reducerer skader på viruspartikler.

Ammoniummolybdat ved pH 6 og 7 kan anvendes til farvning af frø af sojabønne dværg virusstammer (SbDV). Den vigtigste negative farvning af betydning er at omgive eller indkapsle den biologiske objekt i en særlig elektron tæt materiale, der giver en høj kontrast og god konservering.
positiv farvning :

I denne teknik salte af tungmetaller tillægger de forskellige organel eller makromolekyler i den sektion af øge deres elektrontæthed og fremstår mørke mod en lysere baggrund. Nogle positive pletter er: uranylacetat (UA), citrat Reynoldi af bly. uranyl ioner stærkt reagere med phosphat- og aminogrupper, således at nukleinsyrerne og visse proteiner er stærkt farvede. En 25% opløsning af UA er udarbejdet i absolut methanol. Denne mættet opløsning klares ved filtrering gennem et sprøjtefilter (2 mikrometer porestørrelse) lige inden brug.

Bly i bly-ioner citrat plet Reynoldi binder negativt ladet dele af membraner og osmium-reagerede områder, dvs. Denne plet kan fremstilles ved at tilsætte 1,33 g. bly nitrat og 1,76 g. natriumcitrat i 30 ml. CO2-fri destilleret vand. Det koges i 10 minutter. Til dette mælkeagtig suspension 5 til 7 ml / tilsættes N NaOH. Annullerer suspensionen. Denne stedet lagres i 50 ml målekolbe.
Sammenligning mellem negativ og positiv farvning farvning:

negativ farvning er en teknik anvendt til fremstilling af prøver til undersøgelse under elektronmikroskop. Prøven blandes med en elektron tæt materiale, der trænger ind i mellemrummene i prøven, men ikke prøven af ​​det samme materiale. Prøven derefter vises klart mod en uigennemsigtig baggrund.

Den positive plet-stick med prøven og giver sin farve, i hvilken, som en negativ pletten ikke blandes med mester, men afregning omkring dets ydre kant, der danner en silhuet (outline). Den negative plet frembringer en mørk baggrund omkring cellen (fig. 5).


shadowing metal :

shadowing metal er en teknik, der gør det overflade detaljer om meget små partikler synlige i elektronmikroskop. I denne teknik et tyndt fordampet metallag, såsom guld eller platin er anbragt i en vinkel i en biologisk prøve. Et badeværelse opløser organisk syre

materiale, hvilket efterlader et metal replika af dens overflade, som derefter kan undersøges under et transmissionselektronmikroskop (TEM).

Variation af vinkel og tykkelsen af ​​metallet aflejres at danne et billede, fordi det tillader nogle elektroner ulykker vil blive spredt i forskellige retninger i stedet for at gå gennem præparatet. Hvis metallet aflejringer hovedsagelig på den side af prøven, billedet synes at have "skygger", hvor metallet er mørke og skygger lys.

Positiv farvning bruges også i forberedelsen prøve til undersøgelse i elektronmikroskop, men i denne teknik indebærer makromolekyler eller biologiske strukturer gøres tætte elektroner tillader tungmetalioner af modsat ladning til at binde dem sammen.

metode:

Prøven spredes på en glimmer ark og derefter tørret i en vakuum fordamper. En tung metaltråd såsom platin eller guld er elektrisk opvarmet så metallet fordampning og nogle af dem falder på prøven gitteret i en meget tynd film. For at stabilisere replikation prøven derefter coatet med et carbon film fordampet fra en elektrode over-hovedet. Det biologiske materiale opløses derefter med syre kun observere prøven metal replikation. områder af kulovertrukne elektronmikroskop af et sådant præparat, billedet reverseres sædvanligvis forekommer zoner af lys og skraverede platin er mørke.

frysetørring :

At fjerne fugt (for eksempel fra fødevare) ved først frysning og derefter udsættelse for højvakuum anvendes som vildtype fremgangsmåde til tørring af levnedsmidler og kemikalier, mens forårsager lidt nedbrydning kaldes frysning eller tørring af en fødevare eller blodplasma tørringsmetode eller farmaceutiske eller væv uden at ødelægge deres fysiske struktur, at materialet er frosset og derefter opvarmet i et vakuum, således at is sublimeres (for biokemi det lyofiliserede ofte anvendes betegnelsen).

frysetørring teknik hjælper til at opnå en korrekt idé om formen af ​​partiklerne. Morfologien af ​​virusset er blevet undersøgt med en række forskellige elektronmikroskopiske metoder. Men de fleste af disse teknikker kræver en forbehandling, der kan indføre strukturelle ændringer i objektet. Metallet skygning og negativ farvning som ikke kræver fastgørelse kan forårsage krympning under tørringsprocessen.

Endvidere kan de forandre eller ødelægge objektet som det blev påvist, at de hele viruspartikler. For at overvinde skadelig udtørrende virkning på den biologiske struktur Wychoff forsøgt at forhindre virus ved frysning røret i en kold metalblok og afdampning af is i en vakuuminddamper. Williams har udviklet en forbedret procedure til lyofilisering af vira, membraner, etc.

metode:

Farvningen frysning teknik er blevet beskrevet detaljeret af Williams (1952). Denne teknik indebærer hurtig frysning af prøven og det tynde lag af vand dækker på gitteret, som blev adsorberet efterfulgt af sublimering af isen omkring det. En tynd, tung metallag afsættes derefter på overfladen dehydreret for at tilvejebringe kontrast.


Carbon Replica :

Udarbejdelse af kulstof ligner gips forme replikation er udarbejdet i mange tilfælde for at fremhæve overfladen karakteristika for de virale partikler.

Betydningen af ​​elektronmikroskopi:

Elektronmikroskopi viser morfologien og tillade:

(I) Måling af størrelsen af ​​det virale partikel

(Ii) kan indikere mulig genre

(Iii) Nyttig når du ikke ved noget om identiteten af ​​virus.

(Iv) resultaterne inden for 1-2 timer.



Efterlad en kommentar