Elektronmikroskopi (EM) af basisstrukturen




Biocenter Oulu Electron Microscopy Core Structure tilbyder ydelser og uddannelse i de forskellige elektron mikroskopi teknikker til analyse af biologiske prøver. Vi tilbyder også teknisk og videnskabelig rådgivning inden for eksperimentel planlægning og dannelsen af ​​prøveforberedelse og drift af elektroniske mikroskoper. Med alle de analyseteknikker er EM valgfri. Vi specialiserer os i IEM og ultrastrukturelle analyse af modificerede gener mus væv.

service

  • Plastic indlejring, tynd sektionering
  • Højtryk frysning og fryse substitution (HPF-FS)
  • Immunoelektronmikroskopi (IEM)
  • negativ farvning
  • tomograf
  • Applikationer SEM / Fokuseret Ion Beam - scanning elektronmikroskopi (SEM-FIB)
  • SEM Programmer / korrosion støbt teknik

oplysninger

  • instrumenter
  • booking instrument
  • prøveforberedelse laboratorium
  • kontaktpersoner
  • Montagevejledning af prøverne
  • formular ordre
  • priser

publikationer

  • BCO EM Publikationer 2012-2015

indlejring
Plast og tynd sektionering

Prøve er fastgjort både med en blanding af 4% paraformaldehyd og 1% glutaraldehyd i 0,1 M phosphatpuffer, eller 2% glutaraldehyd i 0,1 M phosphatpuffer, post-fikseret med osmiumtetroxid, dehydreret med stigende koncentrationer af acetone eller alkohol og indlejret i plast harpiks (Epon). Ultratynde snit (70-80 nm) er post-farvet med uranylacetat og bly-citrat før observation med TEM.



tynde sektionerede prøver Epoxy indlejrede viser ultrastruktur af E. coli, neuromuskulære forbindelse af musklen af ​​musen, barrieren af ​​muse nyre glomerulus filtrering og svin cerebral cortex neuron.

Højtryk frysning og fryse substitution (HPF-FS)

En af de bedste til rådighed for udarbejdelsen af ​​den biologiske prøve til elektronmikroskopi med hensyn til strukturelle bevaring metoder er cryoimmobilization ved højt tryk frysning (HPF) efterfulgt af fryse-substitution (FS). Denne metode giver observation af celler og organeller i cellen blev siden til ingen indfødte artefakter (udvinding, koagulation, strukturel forvrængning), som ofte observeres ved brug af kemiske fiksering. En prøve af celler eller frisk væv er lagt sammen med fyldstof eller kryobeskyttelsesmiddel på en prøveholder og straks nedfrosset ved meget højt tryk (2000 bar) ved hjælp af HPF maskinen. Frysningen er efterfulgt af udskiftning frysning, hvilket sker ved en temperatur under -70 ° C, hvor vandet (i form af is) i prøven erstattes af organisk opløsningsmiddel i nærværelse af sekundære fiksativ. Efter udskiftning prøverne kan indlejres i plast eller rehydreret og behandles med Tokuyasu teknik til IEM.

tynde prøver integreret epoxy sektioneret gær S. cerevisiae (til venstre) og mus nyre (til højre), som blev løst med HPF-FS-metoden.

Immunoelektronmikroskopi (IEM)

For lokalisering af molekyler på den ultrastrukturelle niveau, vi anvender teknisk cryosectioning Tokuyasu. frisk prøve er fikseret i 4% paraformaldehyd i 0,1 M phosphatbuffer, nedsænket i 2,3 M sucrose i PBS og frosset i flydende nitrogen. tynde kryosektioner er mærket med specifikke antistoffer og konjugerede guld markører anvendes til at vise bindingsstederne af antistofferne.

HPF-FS behandlede nyre prøve af muse rehydreret og behandlet med Tokuyasu metode til at vise lokaliseringen af ​​type IV collagen i basalmembranen af ​​de renale tubuli (venstre). Cryosectioned af muse nethinden, der viser lokaliseringen af ​​rhodopsin i stang celler (højre).

negativ farvning

enkle og hurtige teknik til at analysere den detaljerede struktur af makromolekylerne, og organeller isoleret ved omgivende mikroorganismer eller inkorporere prøve partikler i en tæt materiale af elektroner, der giver en høj kontrast. En lille dråbe prøve absorberes på en belagt kulstof og glød-udledning gitter. Efter overskydende prøve fjernes, bliver gitteret skylles et par gange på en dråbe destilleret vand og anbragt på en dråbe af farvning (1% uranylacetat og uranyl formiat). Efter farvning af den overskydende væske fjernes, og gitteret tørres forudgående observation med TEM. Du kan også kombinere immunfarvning med negativ farvning. I dette tilfælde antistofinkubationer udføres inden den negative pletten anvendes.

actinfilamenter negativ farvning (venstre). Den immunolabelled for decorin og collagenfibre farvet med uranylacetat (højre).

tomograf

Elektronmikroskopisk tomografi er en teknik, der tillader undersøgelse af tredimensionale biologiske strukturer. tynd prøve vippes i en bred vinkelområde (typisk ± 70 °) omkring tilt akse goniometer stadium og genoptaget på ethvert hældningsvinklen (normalt med intervaller på 1 eller 2 °). September tilt serie kaldet billede opnået behandles derefter at bringe billeder med hinanden og rekonstruere et tredimensionalt volumen. Denne mængde vises som en serie af billeder, der viser parallelle skiver gennem volumen. Direkte visualisering af lydstyrken kan være oplysende for nogle strukturer og analytiske formål. Imidlertid er segmentering metoder anvendes ofte med organeller strukturer til at definere og dissekere konstruktionens dele og skabe en tredimensionel model, der letter fortolkningen, opdagelsen af ​​indbyrdes, og måle.

Applikationer SEM / Fokuseret Ion Beam - scanning elektronmikroskopi (SEM-FIB)

Med denne metode er det muligt at opnå en serie billeder gennem harpiks indlejret væv blok konventionelt fremstillet. kan derefter bruges serier af høj opløsning justeret til genopbygning af 3D-volumen, og ultrastrukturelle analyse af cellulære strukturer. I mikroskop for at fordoble kilden elektronstrålen af ​​gallium ioner fokuseret elektronstråle og er anbragt i en vinkel, der tillader fjernelse lag til lag af materiale fra prøveoverfladen og den efterfølgende eksponering med en scanning elektronstråle. Proces er fuldstændig automatiseret, og når området er egnet og fræsning og billedbehandling parametre er indstillet, vil instrumentet automatisk producerer serie af billeder næsten på linie.

retvinklede synspunkter serie af billeder opnået fra hjertevæv ved hjælp af musen skive og udsigt teknik med FIB-SEM (til venstre). 3D-model af en kapillær hjerte, hvor de blev segmenteret endotelceller (blå og cyan), der danner kapillære og pericytes (grøn) omgiver den kapillære og overfladen gengivet (højre).

SEM Programmer / korrosion støbt teknik

Vaskulær korrosion støbning er et fremragende værktøj til morfologisk undersøgelse af organer og væv mikrocirkulationen i normale og patologiske tilstande. Kort fortalt mus eller rotter perfunderet og blodet er erstattet med en lav viskositet harpiks. Efter at harpiksen er hærdet, er KOH maceration bruges til at fjerne det omgivende væv, og påvisning af replikation af vaskulaturen. På grund af polyurethan-harpiks (PU4ii) casts er højelastisk og formen og mængden af ​​organer, er bevaret. Casts tages normalt med SEM, de kan bearbejdes yderligere til analyse ved konfokal mikroskopi (harpiks er autofluorescerende), mikro-computertomografi (microCT), eller af optisk projektion tomografi (OPT), der tillader produktion af 3D rekonstruktioner af morfometrisk kvantitativ analyse.

Vaskulær korrosion støbt af muse nyre observeret i stereomikroskop (venstre). SEM-analyse af muse-korrosion nyre kastet viser forskellige spoler, der danner smalle kapillærer glomeruli (højre).

værktøjer:

  • Tecnai G2 Spirit 120 kV TEM med Veleta og Quemesa CCD-kameraer (BF-finansiering)
  • Sigma HD VP FE-SEM udstyret med ET-SE og In-linse SE detektor, G3 VPSE detektor til lavt vakuum-tilstand, og detektor 5Q-BSD

Position - Hovedbygningen af ​​Medical Campus, Aapistie 5A (Tecnai Room 467B, 492B room CM100, Sigma FE-SEM Room 320A),
tlf: + 358- (0) 294 486144, ext. 48-6144 (Tecnai), 48-6146 (CM100)

Booking Tool:

Instrumenterne kan bookes gennem bogen reservation Asimov:

  • Tecnai G2 TEM Spirit
  • Sigma HD VP FE-SEM

prøveforberedelse laboratorium

Lab er udstyret med moderne instrumenter til fremstilling af celler, organeller og vævsprøver for de forskellige EM analyse.

Udstyr:

  • ultramikrotom Leica EM UC7 angreb med cryo-EM og EM FC7 CRION ionizer
  • ultramikrotom Leica EM UC6 angreb med cryo-EM FC6
  • Ultracut Leica UCT ultramikrotom
  • Leica E Ultracut
  • EM-pagten højtryks frysning indretning (Leica)
  • Leica EM AFS2 fryse-changer med automatiske flydende håndteringssystem (BF-finansiering)
  • Leica EM TP automatiseret vævsprocessor
  • K850 Kritisk Punkt Dryer
  • ES Q150T værktøj med udskiftelige indsatse for sputtering belægning eller carbon fordampning udstyret med den lagtykkelse skærm og indsæt glød udledning

Placering - laboratorium EM, Biocenter Oulu laboratorier i hovedbygningen af ​​Medical Campus, Aapistie 5A (Room 488B, 4. sal)
tlf: + 358- (0) 294 486144, ext. 48-6144

Kontaktpersoner:

Ilkka Miinalainen, koordinator
tlf: + 358- (0) 294 486145, ext. 48-6145
E-mail: ilkka.miinalainen (at) oulu.f

Udarbejdelse af laboratorieprøver:
Sirpa Kellokumpu, Tarja Piispanen
tlf: + 358- (0) 294 486144, ext. 48-6144
E-mail: firstname.lastname (at) oulu.f

prøver monteringsvejledning:

Tissue fiksering for TEM og IEM

fiksering af dyrkede celler ved TEM og IEM

Fiksering af organeller blokke til TEM og IEM

Bestil formular:

Hent bestillingssedlen.
(Bemærk: Hvis du har problemer med at bruge formularen i browseren, så prøv at gemme dokumentet og udfylde det i Adobe Acrobat / Reader)

priser:

Priser for akademiske grupper
Priserne for kommercielle brugere



Efterlad en kommentar