En bedre identifikation af gær arter direkte fra positiv blod kulturmedier ved en kombination af behandling af prøver sepsityper




MicroFlex og analyse med ionisering systemet biotyper matrix-assisteret laser desorption

I denne pilotundersøgelse, vi undersøge brugen af ​​MALDI Biotyper systemet, der kombinerer en blodprøve af den gennemsnitlige arbejdstid kultur Kit (MALDI Sepsityper), en analysator MALDI-TOF MS (Microflex), og en dedikeret software (MALDI Biotyper, version 2.0), for hurtig identifikation af gær-lignende patogener direkte fra plottet af positive blod kultur. Med yderligere to forbehandling vask trin, har systemet opnået en detektionsgrænse på 105 CFU / ml med intra- og interspecimen tilfredsstillende reproducerbarhed. Hele proceduren, fra udvinding af den endelige prøve resultater rapportering, kan være afsluttet inden for 1 time, der tilbyder en anden pålidelig værktøj til hurtig identifikation af gær direkte fra landet med de positive blod kultur.

gær-lignende svampepatogener er blandt de mest almindelige ætiologiske agenter for invasive svampeinfektioner og ses også Nosokomielle infektioner i blodet. invasive svampeinfektioner og svampeinfektioner nosokomielle blodbanen infektioner er livstruende, med 60 og 49% generelle og specifikke dødelighed, henholdsvis (20). Valget af en effektiv behandling for candida afhænger af arten Candida infektiøse. Der er mere end 20 arter af Candida, hver med forskellige antifungale modtagelighed profiler (20, 30). På nuværende tidspunkt artsbestemmelse kræver 2 til 5 dage efter indsamling af blodprøver for kultur fra patienter. MALDI-TOF MS-baserede identifikation har potentiale til at forkorte tiden til resultater, hvilket giver en væsentlig reduktion forsinkelsen, før du starter eller justering for en effektiv behandling til at forbedre den terapeutiske virkning, minimere negative virkninger, reducere omkostningerne og reducere risikoen for udvikling af resistens (6, 24).

tidligere 

offentliggjort indsats på identifikation af de gær prøver ved MALDI-TOF MS-baserede procedurer direkte fra gær indeholder blodprøverne for positiv kultur har ført til forskellige resultater (8, 9, 16). I denne situation, gær-lignende svampe dyrket i jord af kompleks sammensætning væske for tilstedeværelse af både gennemsnitlig proteiner og blodceller. Især hæmoglobin, proteiner og peptider afledt af leukocytter og serumproteiner Det skal kasseres, såsom de gav stærke signaler i massespektre som hæmmer fortolkningen af ​​de specifikke toppe. udvikling af en behandlingsprotokol af standardiserede prøver og effektivt at de interfererende materialer og den klare mikrobielt protein udbytte fjerne komponenter er kritisk (10). I denne undersøgelse, vi tilpasset og optimeret et kommercielt kit, MALDI Sepsityper for dyrkningsmedium prøve positiv blod transformation. Det er vores erfaring, at Sepsityper kit har følgende karakteristika: (i) identifikation af mikroorganismer direkte fra positive blodkultur flasker er nem og hurtig (under 30 minutter); (Ii) prøven forberedelse protokollen enkle og bruger kun 1 ml af prøvematerialet, korte centrifugeringstrin, og kun ét rør for hver analyse; (Iii) identifikation Gær er betroet af MALDI Biotyper system og (iv) alle reagenserne og hjælpematerialer kræves til behandling af blod kultur fluid er tilvejebragt i kittet klar til brug. Vi har tilføjet to vaske faser af proceduren før MALDI prøve Sepsityper analyse for at fjerne røde blodlegemer og proteiner. Denne ændring gjorde MALDI Sepsityper et effektivt redskab til forarbejdning positive blodkulturmedier indeholder gær-lignende patogener.

I modsætning til publicerede protokoller, der besatte differentiel centrifugering til isolering af mikroorganismer i en positiv blod kultur og normalt har fejlet i identifikationen af ​​gær, denne metode ødelægger menneskelige celler (hvide og røde blodlegemer) ved lyse. Lysisopløsningen anvendt i denne undersøgelse blev designet til at lysere kun celler af humant blod og ikke mikroorganismer. derfor, i high-speed centrifugering faser, kun mikroorganismer, som ikke er berørt af lyse fase på grund af deres robusthed cellevægge, udfældes. På denne måde indblanding af hvide blodlegemer svarende til den, sedimenterede gærceller og derfor ikke kan adskilles fra dem ved hjælp af differentialcentrifugering, forhindres det. Vi har også anvendt to yderligere vaskninger trin før Sepsityper procedure, der har bragt mere reproducerbare og tilfredsstillende resultater på grundlag af identifikation af mikroorganismer i alt 42 kliniske prøver.

Følsomheden af ​​MALDI-TOF MS for at identificere mikroorganismer i blodet klart det afhænger af inokulum (9, 10). standardtilsætningsforsøg med Staphylococcus aureus og Escherichia coli har vist, at organismerne i 107 til 108 CFU / ml blev korrekt identificeret, mens 106 CFU / ml producerede signaler, der var til at skelne fra fonden til negative kontroller, hvilket indikerer, at det var nødvendigt at indbetale mindst 104 til 105 CFU på MALDI målplade til at opnå et spektrum af identifikation (4). Endvidere skal inokulum indeholde mikroorganismer tilstrækkelig til at overvinde peak baggrund afledt af blod under måling. I vort eksperiment opnåede vi en detektionsgrænse på 105 CFU / ml af en klinisk prøve med C. parapsilosis, som er mere følsom end tidligere rapporteret. Dette kan henføres til tilpasning og beskæftigelse af MALDSepsityper Kit til behandling af 1 ml af en positiv blodprøve. Den Sepsityper kit selv er langt mere effektiv til fjernelse af de interfererende humane celler (røde og hvide blodlegemer) fra den komplekse blanding og beriger mikroorganismer i større forholdet sammenlignet med andre metoder. Desuden både identifikation registreringsdatabasen (score) CV intra og interstamme værdi var små, hvilket tyder at Sepsityper kit til forberedelse af prøven besad tilfredsstillende reproducerbarhed resultater svarende til dem, der opnås med metoder til identifikation af bakterier og sygdomsfremkaldende gær (18, 28).

Sammenfattende direkte metode MS fingeraftryk med behandling af prøven til MALDI Sepsityper modificeret kit giver en gunstig kombination af prøvehåndtering, præcision, reproducerbarhed, korte leveringstider og beskedne omkostninger reagenser. mens vores pilot undersøgelsens resultater de er lovende, mere positiv blod dyrkningsmedium indeholdende gær prøver, der dækker en bred vifte af genrer og arter skal testes til fuldt ud at evaluere denne revolutionerende potentiale mikrobiel identifikation værktøj.



Efterlad en kommentar