Farvning rødder




Ved udtagning af prøver rødder til at påvise og / eller måle mængden af ​​mycorrhiza kolonisering, er det vigtigt at vælge den finere, mere fibrøse rødder. ældre rødder eller dem fra planter med øjebolte eller andre grove rødder, kan have nogle mykorrhiza, men ususally kolonisering er dårlig, og består kun af hyfer, der ofte er mere synlig uden for rødderne. For anlæg med en fibrøst rodsystem, så en stikprøve nok. Darkly pigmenterede rødder bør undgås brug betyder at passere gennem en fase med yderligere blegning (inkubation ved 5% blegemiddel i 5-10 minutter er normalt tilstrækkelig, men det skal testes empirisk).

Efter grundig vask til fjernelse af alle partikler, er rødderne anbragt i plastkasser, der anvendes i medicin til behandling af biopsi væv. Forskellige typer af kassetter markedsføres (Fischer, Ted Pella, etc.), men det bedste for rodprøver er rektangulære i form med 0,9 mm huller (billedet til højre). Kassetter med større huller resultere i produktion af rødder, især når rødderne skæres i små fragmenter. Emballage rødder frit i kassetter (0,1-0,2 g max) for den maksimale infiltration af løsninger.



Rødderne er ryddet (fjernelse af cytoplasmatiske indholdet af cellerne) med varm 10% KOH. Der anvendes flere tilgange, ved autoklavering kassetter i 5-10 minutter til at koge i en container på laboratoriet bænken. Meget afhænger af antallet af prøver, der skal behandles samtidigt. Vi normalt kun behandle 10-20 prøver ad gangen. At minimere uro, er preboil KOH i et stort bægerglas på en bunsenbrænder, og tilføj straks kassette, når brænderen er slukket. Inkubationstiden varierer med tykkelsen og skrøbelighed af rødderne, men 10 minutter er sædvanligvis tilstrækkelig. Gamle tykkere rødder kræver længere inkubationstid. Bruning af opløsningen er en indikation af kompensationsprocessen.

Da de fleste af de histologiske pletter anvendes til denne procedure er sure, er det afgørende, at rødderne skal forsures. Så vi vasker rødder (4 -5 x), og derefter dyppe båndene ved 2% HCI i 15-20 minutter. For rødder fra stærkt alkalisk jord, anbefales det længere inkubationstider. Hvis rødderne er ensartet mørk og mykorrhiza er svært at se, så utilstrækkelig kompensation er ofte årsag.

Den samme procedure som beskrevet ovenfor for at fjerne rødder udføres igen, kun direkte andre pletter 0,05% blå eller andet egnet (syre fuchsin, chlorazol sort E). Pletten blev fremstillet ved blanding med vand, glycerin og mælkesyre i 1: 1: 1 forhold (volumen / volumen / volumen). Inkubationstiden varierer, men 3-4 minutter virker bedst for os med drivhus planter. I det rigtige billede, blev båndene tilsat til farvestof indeholdende rødder, opvarmet på et laboratoriebord med en bunsenbrænder, brænderen fra, når opløsningen begynder at koge. Dette trin kan udføres uden anvendelse af varme, men inkubationstiden skal derfor udvides til 12 timer.

Pletten dekanteres over i en anden beholder (der kan genbruges 1-2 gange efter filtrering gennem ostelærred) eller kasseres på en wastebottle. Skyl kassetterne med 4-5 skift af vand og opbevares ved 4 ° C i vand. Mere kontrast mellem væv svampe og planteceller baggrund opnås, når prøverne blev opbevaret i vand i en uge eller mere i køleskab (overskydende farvestof udvaskes fra rødderne).

For langtidsholdbarheden af ​​de farvede rødder, vi sætter dem i glasrør med skruelåg indeholdende en blanding af glycerin-vand (2: 1 v / v) med 1-2 dråber natriumazid 0,1% ved 4 ° C. Stain tilbageholdes i vævet fungal per> et år. Rødderne kan opbevares i fikseringsopløsning samt (såsom formalin), men kun hvis du ønsker at kontrahere allergier, kræft eller andre mulige sundhedsmæssige problemer.

mykorrhiza farvet med 0,05% syre fuchsin som alternativ plet

REFERENCER

Phillips, J. M. og D. S. Hayman. 1970. forbedret fremgangsmåde til at fjerne de rødder og mycorrhiza svampe farvning parasitter og vesikulær-arbuskulær for en hurtig vurdering af infektion. De britiske operationer Mycological Society 55: 158-161. (Classic Card)

Koske, R. E. og J. N. Gemma. 1989. En modificeret procedure til farvning rødder til påvisning VA mycorrhiza. Mykologiske Research 92: 486-505.

McGonigle, T. P., M. H. Miller, D. G. Evans, G. L. Fairchild og J. A. Swan. 1990. En ny metode, som giver et objektivt mål for rod kolonisering af vesikuløse-arbuskulære mycorrhiza svampe. New Phytologist 15: 490-501.




Efterlad en kommentar