Funktionen af ​​flavin cytoplasmatisk reduktase i reduktionen af ​​azofarvestoffer med bakterier




Der er talrige rapporter, der beskriver reduktionen af ​​azoforbindelser af bakterier i anaerobe betingelser. Den største interesse på dette område har fokuseret på bakterier i tarmen, der er involveret i metabolismen af ​​azofarvestoffer indtages som tilsætningsstoffer, og der er nogle undersøgelser, der peger på bakterier isoleret fra jord systemer eller spildevandsbehandling ( 5, 6, 8, 27, 29, 31). Tidligere undersøgelser har primært været gennemført med fakultative anaerobe bakterier (f.eks Proteus vulgaris, Streptococcus faecalis, eller Bacillus sp.). Havde været gentagne gange foreslået, at der i disse stammer, cytosolisk reduktase flavin-afhængige er ansvarlige for denne reaktion er ikke specifik, og at den lave permeabilitet af cellemembraner for højt polære sulfonerede azo-forbindelser vil medføre betydeligt lavere reduktion observeret med hel celle sammenlignet som i acellulære systemer (19, 27, 36). Fordi ingen af ​​disse azo cytosolisk reduktase er aldrig blevet renset, så vidt det har været spekulative hvis reduktase bakteriel Flavin var ansvarlige for azo-reduktase aktivitet observeret med bakterielle celleekstrakter. Den foreliggende undersøgelse har vist, at Flavin reduktase er faktisk i stand til at fungere som azo-reduktase og af celleekstrakter indeholdende det klonede Flavin reduktase affarves en bred vifte af azofarvestoffer industriel interesse.

Vores resultater tyder på, at reduktionen af ​​sulfonerede azofarvestoffer ved reducerede flaviner dannet af cytosole flavin-afhængig reduktase azo meste observeret in vitro og in vivo er af ringe betydning. Dette er blevet klart med den rekombinante stamme BN6 (pRJR34), og in vitro markant øget azo-reduktaseaktivitet sammenlignet med vildtype, selv om det har vist sig in vivo kun en lille stigning azo-reduktase. Teoretisk set kunne dette også være forårsaget af en mangel på nødvendige cofaktorer (NADH og / eller gratis flaviner) i hvilende celler. Dette synes at være usandsynligt, fordi cellerne inkuberet anaerobt bør besidde temmelig høj koncentration af NADH. Der er kun begrænsede oplysninger om indholdet Flavin fri af bakterieceller. Det blev imidlertid observeret, at rekombinante luciferase FMN-medarbejdere er fuldt funktionel i forskellige bakterielle miljøer uden samtidig overførsel af rekombinant FMN reduktase (34). Dette er også blevet vist for nylig for BN6 stamme (J. Klein, personlig kommunikation). Dette antyder, at en fri reduktion flaviner er til stede i forskellige bakterier og også i BN6 stamme i mængder, der tillader støtte af enzymatiske reaktioner, der kræver reducerede flaviner.



yderligere tegn på, at azo-reduktase Flavin-afhængige er næsten helt laboratorie artefakter er blevet påvist af virkningerne af flaviner tilføjet eksternt på azo satser reduktion i anaerobe forhold. Således har det vist sig, at tilsætningen af ​​FAD til en stamme af BN6 hvilende cellesuspension resulterede i nogen signifikant stigning i azofarvestof reduktion. Tværtimod tilsætning af den samme koncentration af anthraquinon-2,6-disulfonat resulterede i en stigning på næsten 10 gange hastigheden af ​​reduktion af farvestoffet (17). Lignende observationer blev også lavet med Sphingomonas sp. stamme BN6 (pRJR34) og E. coli JM109 (DE3) (pEE1001) (upublicerede resultater). Dette antyder, at de bakterielle membraner er ikke kun effektiv hindringer for udbredelsen af ​​sulfonerede azofarvestoffer, men også er næppe gennemtrængelig for flavin-holdige cofaktorer og således begrænse overførslen af ​​reducerende ækvivalenter fra flaviner fra cytoplasmaet af intakte celler af sulfonerede azofarvestoffer i dyrkningsmediet. Således i levende celler med intakte cellemembraner, andre enzymsystemer og / eller andre redoxmediatorer formentlig ansvarlig for reduktionen af ​​azofarvestoffer. I bakterier, som ejer transmissionssystemer af elektroner i deres membraner, såsom bakterier rent aerobe eller fakultativ anaerobe undersøgt i denne rapport, kan overførslen af ​​redox ækvivalenter af den respiratoriske kæde af cellemembranerne til passende redox mediatorer foregår direkte. Hvis intracellulær reduktase bør inddrages i denne proces, kan det antages, at andre end flavin co-faktorer mæglere skal inddrages. En forudsætning for disse mediatorer ville have en større evne til at overføre bakterielle membraner end flaviner.

Et andet koncept til reduktion af sulfonerede azoforbindelser som heller ikke kræver en membran transport af farvestofferne er blevet foreslået for strengt anaerobe bakteriestammer af mikrofloraen i tarmen. Rafii og isolerede forskellige menneskelige samarbejdspartnere bakterier fra tarmen (for eksempel Eubacterium sp., Clostridium sp., Butyrivibrio sp., Or Bacteroides sp.), Affarvet Hvad sulfoneret azofarvestoffer under vækst på fast eller flydende komplekst terræn. E 'blev vist, at mindst en del af de azo reduktaseaktivitet var ekstracellulære, fordi supernatanter kunne affarve farvestofferne under anaerobe betingelser (24, 25). Denne ekstracellulære azo-reduktase aktivitet skyldes aktiviteten af ​​specifikke proteiner, fordi efter denaturerende SDS-PAGE og farvning aktivitet under anaerobe betingelser, sædvanligvis kun én distinkt proteinbånd i gelen blev i stand til at blege farvestoffer (21). I de fleste af isolaterne, var nødvendige for azoforbindelser flavin reduktase, men i nogle clostridier, azo reduktaseaktivitet var uafhængig flavine tilsat eksternt (24). For nylig blev et DNA-fragment fra Clostridium perfringens klonet i fag GT11, der har øget AZO reduktase aktivitet af lytiske og lysogene kulturer af E. coli inficeret med den rekombinante fag (23). Azo-reduktase fra C. perfringens blev påvist ved immunoelektronmikroskopi hele cytoplasmaet og i nærheden af ​​cellerne (22). Dette antyder, at proteinet er ikke en typisk ekstracellulær enzym, men som formentlig kun frigives fra de lyserede celler. Azo reduktaseaktivitet ved C. perfringens er klart forskellig fra Flavin reduktase undersøgt i dette studie, fordi enzymaktiviteten er blevet beskrevet som uafhængig af fra flaviner tilsat, og, også blev enzymet hurtigt og irreversibelt inaktiveret med oxygen (24). Det er stadig uklart i dette system, da azoreductases ekstracellulære stikpiller skal indhente NADH nødvendig for reduktion af azofarvestoffer i deres ekstracellulære miljø, og der kan være nogle effekter fra de komplekse midler til vækst af bakterier. Derudover er der nogle andre publikationer om reduktion af azoforbindelser til helcellepræparater af strengt anaerobe bakterier, der har foreslået at inddrage redoxmediatorer (3, 4). Derfor er det ikke utænkeligt, at de ekstracellulære mediator forbindelser deltager også i reduktionen af ​​azo-forbindelser ved strengt anaerobe bakterier.

Den tredje mulighed for det ekstracellulære reduktion af azofarvestoffer forårsaget af mikroorganismer er virkningen af ​​reducerende uorganiske forbindelser (Fe2 , H2S), der dannes som slutprodukter nogle strengt anaerobe bakterier. Desuden i disse tilfælde kan mægleren forbindelsen har en vigtig funktion (13, 37).

Det kan konkluderes, at, afhængigt af de miljømæssige forhold (eller reaktionsbetingelserne for en bioteknologisk proces), forskellige reaktioner katalyseret af bakterier kan nå en reduktion azoforbindelser under anaerobe betingelser, men at de intracellulære reaktioner har kun ringe betydning i disse reaktioner.



Efterlad en kommentar